Preparación, fijación y coloración simple de un frotis

CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLÓGICO industrial y de servicios No 199

Marisol Sebastián Rendón

Laboratorista Clínico

4 "DM"

Practica No 1

Preparación, fijación y coloración simple de un frotis

Procesar cultivos bacteriológicos

Profr. Dr. Vicente Martínez Fragoso

objetivo: Aprender a realizas las diferentes técnicas de preparación de frotis, de fijación y de coloración que son utilizadas para ver la morfología microscópica de los cultivos bacterianos que pueden ser mediante medios sólidos y líquidos

Introducción:

un frotis es la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objetivo de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida.

 Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados.

 La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber, posteriormente se realiza una tincion simple que es una tinción sencilla en la cual la bacteria es teñida con un solo reactivo. Es preferible utilizar tintes basicos que contengan un cromógeno con carga positiva, ya que la pared celular de las bacterias posee componentes con carga negativa que atraen y enlazan el cromógeno. La tinción simple se utiliza para observar la morfología y arreglo en el crecimiento de las bacterias

Materiales:

- mechero de bunsen

- aza de platino

- cuba

- pizeta

microscopio

- tubo de nesayo

- centrifuga

Reactivos

- azul de metileno

- aceite de inmersión

- solucion salina

- cultivos bacterianos

Procedimiento:

1) llenar un tubo de ensaye a la mitad con agua destilada, despues tomar un aplicador y e introducirlo a la muestra de heces y disolverlo en el tubo con agua

2) Tomar un poco de horina, depositarla en otro tubo de ensayo y centrifugar durante 5 min a 3000 rpm

Preparacion del frotis:

1) Lavar perfectamente portaobjetos, secarlos con papel y rotularlos

2) limpiar la zona con donde se va a trabajar

3) esterilizar la aza en el mechero hasta que se vea de un color rojo vivo

5) Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Despues acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapon y flamear rapidamente la boca del mismo, introducir el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra (En esta practica no se trabajo con cultivos liquidos).

   

6) Para el caso de cultivos liquidos, colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extender suavemente en una área circular de 2 cm de diametro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis al aire

  

7) Si el cultivo es en medio solido, previamente se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada en la que se mezcla una pequeña muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del paso 5, extenderla suavemente y dejar secar al aire

 

 

8) Del tubo con la muestra de heces, se flamea el asa, se deja enfriar y se mete al tubo para tomar un poco de la suspension, que posteriormente se extiende en el portaobjetos

9) Si hay sedimento en la orina, se decanta y se extiende el sedimento en el portaobjetos, con ayuda del asa previamente flameada

Fijación del frotis

1) Fijar los frotis de cultivos líquidos con dos gotas de metanol o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto en zonas alejadas del mechero)

2.   

Lo2) frotis de cultivos sólidos, completamente secos se fijaran con calor. Para esto se pasará el frotis rápidamente 2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero

Tinción simple

1) colocarle 2 gotas de azul de metileno al frotis durante 30 seg a 1 min

2) Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de una piseta con agua

3) Dejar secar al aire

4) observar al microscopio con el objetivo 10X, 4OX y 100X utilizando el aceite de inmersión

Observaciones:

En este medio de cultivo es de una muestra de exudado vaginal y aqui podemos observar colonias puntiformes con bordes lisos y una elevacion plana de color crema

en este campo podemos observar bacterias de morfología coco- bacilo y se trataba de una bacteria llamada gardnella vaginalis que su habitat natural es en la vagina de la mujer

en esta imagen podemos observar bacterias de morfología cocos y tambien algunos cristales

Conclusión:

Esta practica nos sirvio para recapitular lo que ya habiamos visto anteriormente en otra materia pero ahora nos enfocamos mas en bacterias de la fam enterobacteriae, y nos sirvio para reforzar mas nuestros conocimientos aprendiendo que para preparar un frotis de un cultivo solido se necesita colocarle una gota de agua destilada y para el medio liquído ya no es necesario y entendemos por frotis a la extension que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo pero para ello debemos de fijarla para que las bacterias queden adheridas al vidrio e inactivadas pero sin alterar su morfologia y que no queden amontonadas y despues se debe realizar una tinción para poder observar con mayor facilidad la bacteria, tambien hace que aparezcan mas grandes y en este caso utilizamos un colorante cargado positivamente para que se combine con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente. La coloración positiva es la tinción de los microorganismos, efectuada con colorantes básicos que, como ya dijimos, poseen afinidad por los constituyentes celulares y se combinan químicamente con el citoplasma microbiano

Bibliografía:
 http://www.monografias.com/trabajos15/tinciones/tinciones.shtm consultado el dia 18 de merzo del 2012

http://www.slideshare.net/andresricote/tincin-simple-presentation consultado el dia 18 de marzo del 2012

http://mx.answers.yahoo.com/question/index?qid=20081004120212AAa1hrX consulatdo el dia 18 de marzo del 2012