Preparación y esterilización de materiales y de medios de cultivo

CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLÓGICO industrial y de servicios No 199

Marisol Sebastián Rendón

Laboratorista Clínico

4 "DM"

Practica No 2

Preparación y esterilización de materiales y de medios de cultivo

Procesar cultivos bacteriológicos

Objetivo:

saber cuales son las principales técnicas de esterilización  de los materiales de vidrio y aprender a preparar medios de cultivo, saber que cada medio es para cada bacteria u hongo y tambien que para preparar un cultivo debemos de tener esterilizado nuestro material que vamos a utilizar para que evitar contaminaciones insesarias

Introducción:

Los microorganismos, como todos los otros seres vivos, son verdaderamente susceptibles a los cambios de las condiciones  ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de hábitats incluyendo los de condiciones extremas  de   tipo   físico   y   químico.

 

La esterilización   es  la destrucción  total  de todos los microorganismos  tomando encuenta  las formas   vegetativas y   las  esporas   y  para   lograr   esto   existen   varios   medios   como   son   la   acción   de los    agentes   químicos   y    físicos

 

Los   principales   métodos   de   esterilización   que   se emplean   mas  comunmente  en   un   laboratorio   es   el    calor   húmedo, seco   y   filtración   de   estos   el   mas    recomendable   es   el   la   tecnica de   autoclave

 

Un   medio   de   cultivo   consiste en   un   gel    o una solución   que   cuenta con los nutrientes necesarios para permitir bajo condiciones favorables de pH y temperatura el crecimiento de virus, microorganismos, células o incluso pequeñas plantas. Según qué se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones. Generalmente  se  presentan  en forma de polvo  fino o granular antes de ser preparados, al prepararse podemos encontrarlos en estado sólido, semisólido y líquido.

 

Material:

-  portaobjetos

- matraz

- mechero de  bunsen

- olla expres

- gasas

- algodón

- cinta testigo

- papel estraza

-piseta

- cuba

- asa de platino

- tripie

- caja petri

 

Reactivos:

- agar ss salmonella shigella

- agar EMB

- muestra bilogica: heces y orina

- fenol

. colorantes gram

- aceite de inmersión

 

Procedimeinto:

1)  Lavar perfectamente dos matraces con escobillon y detargente y enjaguar con abundante agua corriente

 

2) dejar  secar

 

3)  despues se procede a pesar en una balanza granataria los dos  agres  (SS y EMB)  para 40 ml de agua, se peso de agar SS 2.9 gr y para el agar de EMB se peso 1.49 

4) realizar un tapon con la ayuda del algodon y la gasa y tambien hacer un gorrito con el papel estraza para la boca del matraz

5) despues colocar en un matrz 40 ml de agua destilada

6) despues se agrega el agar al matraz, pero antes debe estar desinfectada la zona donde se va a trabajar , se enciende el mechero y el matrz se coloca en el tripie que tiene la tela de abesto, se deja hervir por un min  

7) despues se retira el matrz y se le coloca el tapon antes flamearlo, se deja enfriar un poco y se prosigue para  llenar  las cajas petri 3/4 partes y se espera a que gelen junto al mechero de bunsen

8) se hace el mismo procedimiento para el agar EMB pero este se va esterilizar en autoclave para ello se le coloca el tapon y el gorrito hecho de papel de estraza con la cinta testigo y se coloca en la olla

9) se va a verter 1/3 parte de agua en la olla expres

10) colocar la base de esta y poner los mecheros de fisher

11) acomodar los medios de cultivo y los materiales

12) cerrarla y esperar a que la temperatura suba

13) dejar que se caliente hasta los 121 grados centigrados y mantener asi por 15 min

14) despues se sacan los matraces y se dejan enfriar un poco, luego se coloca la solución en las cajas petri hasta la mitad igual cerca del mechero hasta gelen

15) luego se prosigue a sembrar las muestras bilogicas de heces y orina para ello se flamea la aza de platino y se toma  un poco de las muestra y se siembra en tres tiempos, esto se hace igual con la orina y las heces simepre frente al mechero

16) despues se dejan encubar en la estufa de incubación

Preparación de frotis:

1) ya despues que transcurrio tiempo se sacan los medios de cultivo y se observan sus colonias macroscopicamente y microscopicamente

.

.2) se lavan los portaobejtos y se dejan secar

 

3) se limpia perfectamnete la zona donde se va atrabajar

 

4) se flamea la aza hasta que este al rojo vivo , se toma un poco de las colnias y se coloca en medio del portaobjetos que tiene un gota de agua destilada

5) fijar el frotis y teñirlo con la tinción de gram

6)  despues se observa el frotis al miscroscopio con el objetivo 10X,  40X Y 100X para ello se utiliza el aceite de inmersión
Observaciones:

Agar salmonella shigella

Aqui se colo orina y  podemos observar colonias que tiene una forma puntifotrme con un borde liso y con una elevación plana 

 

                                                                                                                                                                                                                                                                                       Agar EMB ( con muestra de heces)

Aqui podemos onservar colonias de forma puntiforme, con un borde liso y una elevación plana de color violeta y verde brillante por lo que estas colonias prsentan caracteriastiacas de E.coli

 

frotis de agar  SS con muestra de orina con el objetivo 100X

se observan bacilos gram negativos aunque no se aprecia bien en la imagen

frotis de medio EMB con muestra de heces con el objetivo 100X

se observan bacilos gram negativos  agrupados en palizadas

Conclusión:

Esta practica ya la habiamos realizado anteriormente en otra materia pero nos sirvio para reforzar nuestros conocimientos que ya teniamos anterioremente y tambien nos ayudo arecordar que la esterilizacion es la eliminación total de los todos los microorganismos incluyendo las esporas y que hay diversas tecnicas para esterilizar una de ellas es la autoclave que se utiliza mas en los laboratorios y es la que nosostros siempre utilizamos en la escuela, que es necesario tener bien esterilizado todos nuestros materiales para prepara medios de cultivos y evitar su contaminacion con otros agentes ya que puede alterar los resulatdos del paciente, tambien recoradmos que un medio de cultivo es es una preparación artificial que tiene los nutrientes necesarios para que haya un crecimeinto de microorganismos que nos sirven de gran ayuda para poder identificar la morfología de las bacterias observando sus caracteristicas macroscopicas por medio de sus colonias que se originan y tambien sus caracteristicas microscopicas realizando un frotis y despues hacerle una tinción comola de gram que nos permite hacer una diferienciación bacteriana si es positivo o negativo, tambien se puede observar las agrupaciones de las bacterias

Bibliografía:

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm consultada el 11 de abril del 2012

http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp4.pdf  consultado el 12 de abril del 2012

Métodos de esterilización, consultado el día 12  de marzo del 2012, en http://www.monografias.com/trabajos10/meste/meste.shtm

Recuento de plaquetas en camara de neubauer

CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLÓGICO industrial y de servicios No 199

 

Marisol Sebastián Rendón

 

Laboratorista Clínico

 

4 "DM" 

 

Practica No 6

 

Recuento de plaquetas en camra de neubauer  

 

"Realizar Biometría Hemática"

 

Dr. Vicente Martínez Fragoso

 

Objetivo: Realizar el conteo de plaquetas en un milimetro cubico e interpretar el resultado en la camara de neubauer 

 

Fundamento:

Los trombocitos son células producidas por los megacariocitos en la médula ósea mediante el proceso de fragmentación citoplasmática, se encuentran unas 250 mil x mm3 , su vida media es de 9.5 días y tienen un papel muy importante en la coagulación.

Miden de 3-4 micras de diámetro, son redondeadas, se pueden observar con una tinción azul de crisil brillante, no tienen núcleo, pueden tener una forma esferica u ovalada y son muy fragiles

El recuento de plaquetas  es la medida de concentración de plaquetas que circulan por la sangre y junto a los eritrocitos, leucocitos, concentración de hemoglobina, el valor de hematocrito y los indices eritrocitarios constituyen a hemograma, este es muy importante ya que las plaquetas desempeñan una función vital en la hemostasia

Material

- camara de neubauer

- pipeta de thoma para globulos rojos

- equipo para venopunción

- caja de petri

- microscopio

- papel parafilm

- gasas

- cubrehematimetro

- papel filtro

- tubos de ensaye

Sustancias:

- sangre venosa

- diluyente de plaquetas

Procedimiento:

1) Realizar la venopunción para obtener 10 ml de sangre venosa en un tubo con anticoagulante EDTA

2) llenar la pipeta de thoma hasta la marca 1.0 y limpiar la punta con una gasa

3) completar con el líquido de plaquetas hasta la marca 101 para tener una dilución de 1:100

4) colocar en ambos extremos de la pipeta papel parafilm

5) Se descartan las primeras cuatro gotas y con la quinta gota se carga la camara de neubauer

 

6) despues se coloca la camara de neubauer en una caja petri con papel filtro humedecido en agua para evitar la evaporación y se deja de 10 a 15 min

7) por ultimo se observa al microscopio y se hace el conteo en la cuadricula central donde se cuentan los glosbulos rojos

Observaciones:

Aqui podemos onservar la cuadricula y tambien se aprecian las plaquetas que tienen forma de ovalos y redonda

Resultados:

calculo:
 Numero de plaquetas contadas x 1000

Valores de referencia:
De 150,000 a 400,000 plaquetas por microlitro (mcL).

Nostros contamos 390 y multiplicandolo por 1000 da un resultado de 390,000 plaquetas por mm3 por lo que nos indica un indice que esta dentro de lo normal por los valores de referencia que tenemos

Conclusión:
El recuento de plaquetas es muy importante ya que con este estudio se puede diagnosticar o controlar diferentes enfermedades o para identificar la causa de un sangrado excesivo  y forma parte de una biometria hematica o hemograma, una de las anormalidades es cuando las plaquetas estan altas o bajas y se denominan 

Trombocitopenia (cuando esta baja) que puede deberse a:

-Quimioterapia contra el cáncer
-Ciertos medicamentos
-Coagulación intravascular diseminada (CID)
-Anemia hemolítica
-Hiperesplenismo
-Púrpura trombocitopénica idiopática (PTI)
-Leucemia
-Transfusión de gran cantidad de sangre
-Válvula cardíaca protésica
-Púrpura trombocitopénica trombótica (PTT)
-Celiaquía
-Deficiencia de vitamin k

Trombocitosis (cuando esta alta) puede deberse a:
-Anemia
-Leucemia mielocítica crónica (LMC)
-Policitemia vera
-Trombocitemia primaria
-Extirpación reciente del bazo

En esta practica hubo algunas diferencias a las del conteo de leucocitos y eritrocitos una de ellas fue el liquido, tambien que se utilizo una caja petri para evitar la evaporacion de las plaquetas, pero se utilizo la pipeta de thoma para globulos rojos y tambien se realizo el conteo en el recuadro central donde se hace el recuento de eritrocitos

Bibliografía:
http://html.rincondelvago.com/manual-de-hematologia.html consultado el 11 de abril del 2012

http://recuentodeplaquetas.blogspot.mx/2008/02/recuento-de-plaquetas.html consulatdo el dia 10 de abril del 2012

Recuento de leucocitos

CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLÓGICO industrial y de servicios No 199

Marisol Sebastián Rendón

Laboratorista Clínico

4 "DM" 

Practica No 5

Recuento de leucocitos  

"Realizar Biometría Hemática"

Dr. Vicente Martínez Fragoso

 

Objetivo: aprender a realizar y aplicar la metodología para determinar el número de leucocitos por mm3 y saber contarlos correctamente

 

Fundamento:

 

Los leucocitos por su morfología se clasifican en: Polimorfos nucleares o granulocitos y los mononucleares.

los polimorfonucleares son: Los Basófilos, Neutrófilos y Eosinófilos, y los Mononucleares son: los Linfocitos y Monocitos.

Las principales funciones de los globulos blancos es la Fagocitosis, la defensa inmunológica específica o inespecífica.

 El recuento leucocitario representa el número de leucocitos en un litro de sangre completa. La fórmula leucocitaria tiene por objetivo determinar los porcentajes de las distintas clases de leucocitos normales y anormales en la sangre. A partir de los porcentajes puede incluso calcularse el número real de cada clase de leucocitos por mm3 de sangre (valor absoluto), conociéndose el total de leucocitos.

.

El diluyente que más se utiliza es el de Turk, el cual contiene ácido acético en una concentración hipertónica, esto provoca la destrucción de los eritrocitos, pero, no de los leucocitos, el diluyente contiene además unas gotas de violeta de genciana o azul de metileno, porque así nos permite reconocer más fácilmente a los leucocitos, ya que tiñen ligeramente su núcleo, permitiendo observarlos más fácilmente.

 La sangre anticoagulada se deposita en un líquido que permite evidenciar los leucocitos, manteniéndolos visibles, mientras que los eritrocitos son hemolizados. El recuento del número de leucocitos o glóbulos blancos se expresa por mm3 (milímetro cúbico).

Material:

- Pipeta de thoma para globulos blancos

- Equipo para venopunción

- boquilla blanca

- tubos de ensayo

- papel parafilm

- camara de neubauer

- gasas

- cubrehematimetro

- gasas

- microscopio

- papel absorbente

sustancias:

- solucion turk al 1%

Procedimiento:

1.-Una vez obtenida la sangre con anticoagulante se procede a aspirar la sangre con la pipeta de glóbulos blancos hasta la marca de 0,5 y  limpiar la punta con papel absorbente.

 2.-Introducir la pipeta en el tubo que contenga solución de Turk y absorber hasta la marca de 11 (no debe haber burbujas), para que obtengamos una dilución de 1:20 

3.-Tapar ambos extremos con el papel parafilm y mezclar manualmente o en un rotador automático por 2 ó 3 minutos.

4.- colocar la laminilla de vidrio en la cámara de neubauer para que debe estar limpia y seca.

 5.-Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocar una gota pequeña de esta solución en la cámara para que se llene por capilaridad 

 6.-Deje reposar 3 minutos para que los leucocitos se sedimenten.

 7.-Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angulares

. 

Observaciones:

En esta imagen no se aprecia muy bien los cuadros pero esta enfocado en uno de los cuadros laterales donde se tienen que contar los leucocitos y para realizar la lectura se deben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la línea horizontal superior y vertical exterior, o de lo contrario, todos los leucocitos, adheridos a la línea horizontal inferior y vertical interior.

Resultados:

Leucocitos contados en 4 campos

Nº de leucocitos x mm³ = altura x dilución x área

Leucocitos contados en 4 campos Reemplazando = 1/10 x 1/20 x 4

Leucocitos contados en 4 campos = 4/200 = 1/50

Nº de leucocitos x mm³ = Nº leucocitos contados x 50

4/200

Valores de referencia:

Leucocitos:

-Adultos: 5000 - 10 000 / mm3

- Recién nacidos: 10 000 - 25 000 / mm3

-Niños: 8000 - 15 000

Nosostros contamos en total 110 y al multipliralo por 50 dio como resultado  5500/mm3

y por los valores de referencia esta dentro del indice normal ya que nuestro paciente tenia 16 años de edad

conclusión:

El procedimiento del recuento de eritrocitos es parecido al del conteo de leucocitos pero en este caso se utiliza una pipeta de thoma para globulos blancos y pues donde se hace la dilución es mas pequeña ya que tenemos menos leucocitos que eritrocitos y ahora la dilución sera de 1:20, tambien utilizamos otra sustancia que fue la de turk que es la mas utilizada por que esta conformada por ácido acético en una conentración hipertónica la cual produce la destrucción de los eritrocitos pero no de los leucocitos, tambien tiene unas gotas de azul de metileno para que puedamos observar con mejor clarida los leucocitos ya que tiñe ligeramente su núcleo, otra diferencia es los cuadrantes donde se realiza la lectura de estos que es en los cuatro cuadros angulares como se muestra en esta figura

Bibliografias:

http://html.rincondelvago.com/manual-de-hematologia.html consultado el 1 de abril del 2012

• Martínez Fragoso, Vicente. Manual de Biometría Hemática.CBTis199, México, 2012. Pp. 22-24 consulatado el 2 de abril del 2012

http://es.scribd.com/doc/3246166/practicas-de-hematologia consulatdo el 2 de abril del 2012

Preparación, fijación y coloración simple de un frotis

CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLÓGICO industrial y de servicios No 199

Marisol Sebastián Rendón

Laboratorista Clínico

4 "DM"

Practica No 1

Preparación, fijación y coloración simple de un frotis

Procesar cultivos bacteriológicos

Profr. Dr. Vicente Martínez Fragoso

objetivo: Aprender a realizas las diferentes técnicas de preparación de frotis, de fijación y de coloración que son utilizadas para ver la morfología microscópica de los cultivos bacterianos que pueden ser mediante medios sólidos y líquidos

Introducción:

un frotis es la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objetivo de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida.

 Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados.

 La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber, posteriormente se realiza una tincion simple que es una tinción sencilla en la cual la bacteria es teñida con un solo reactivo. Es preferible utilizar tintes basicos que contengan un cromógeno con carga positiva, ya que la pared celular de las bacterias posee componentes con carga negativa que atraen y enlazan el cromógeno. La tinción simple se utiliza para observar la morfología y arreglo en el crecimiento de las bacterias

Materiales:

- mechero de bunsen

- aza de platino

- cuba

- pizeta

microscopio

- tubo de nesayo

- centrifuga

Reactivos

- azul de metileno

- aceite de inmersión

- solucion salina

- cultivos bacterianos

Procedimiento:

1) llenar un tubo de ensaye a la mitad con agua destilada, despues tomar un aplicador y e introducirlo a la muestra de heces y disolverlo en el tubo con agua

2) Tomar un poco de horina, depositarla en otro tubo de ensayo y centrifugar durante 5 min a 3000 rpm

Preparacion del frotis:

1) Lavar perfectamente portaobjetos, secarlos con papel y rotularlos

2) limpiar la zona con donde se va a trabajar

3) esterilizar la aza en el mechero hasta que se vea de un color rojo vivo

5) Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Despues acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapon y flamear rapidamente la boca del mismo, introducir el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra (En esta practica no se trabajo con cultivos liquidos).

   

6) Para el caso de cultivos liquidos, colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extender suavemente en una área circular de 2 cm de diametro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis al aire

  

7) Si el cultivo es en medio solido, previamente se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada en la que se mezcla una pequeña muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del paso 5, extenderla suavemente y dejar secar al aire

 

 

8) Del tubo con la muestra de heces, se flamea el asa, se deja enfriar y se mete al tubo para tomar un poco de la suspension, que posteriormente se extiende en el portaobjetos

9) Si hay sedimento en la orina, se decanta y se extiende el sedimento en el portaobjetos, con ayuda del asa previamente flameada

Fijación del frotis

1) Fijar los frotis de cultivos líquidos con dos gotas de metanol o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto en zonas alejadas del mechero)

2.   

Lo2) frotis de cultivos sólidos, completamente secos se fijaran con calor. Para esto se pasará el frotis rápidamente 2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero

Tinción simple

1) colocarle 2 gotas de azul de metileno al frotis durante 30 seg a 1 min

2) Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de una piseta con agua

3) Dejar secar al aire

4) observar al microscopio con el objetivo 10X, 4OX y 100X utilizando el aceite de inmersión

Observaciones:

En este medio de cultivo es de una muestra de exudado vaginal y aqui podemos observar colonias puntiformes con bordes lisos y una elevacion plana de color crema

en este campo podemos observar bacterias de morfología coco- bacilo y se trataba de una bacteria llamada gardnella vaginalis que su habitat natural es en la vagina de la mujer

en esta imagen podemos observar bacterias de morfología cocos y tambien algunos cristales

Conclusión:

Esta practica nos sirvio para recapitular lo que ya habiamos visto anteriormente en otra materia pero ahora nos enfocamos mas en bacterias de la fam enterobacteriae, y nos sirvio para reforzar mas nuestros conocimientos aprendiendo que para preparar un frotis de un cultivo solido se necesita colocarle una gota de agua destilada y para el medio liquído ya no es necesario y entendemos por frotis a la extension que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo pero para ello debemos de fijarla para que las bacterias queden adheridas al vidrio e inactivadas pero sin alterar su morfologia y que no queden amontonadas y despues se debe realizar una tinción para poder observar con mayor facilidad la bacteria, tambien hace que aparezcan mas grandes y en este caso utilizamos un colorante cargado positivamente para que se combine con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente. La coloración positiva es la tinción de los microorganismos, efectuada con colorantes básicos que, como ya dijimos, poseen afinidad por los constituyentes celulares y se combinan químicamente con el citoplasma microbiano

Bibliografía:
 http://www.monografias.com/trabajos15/tinciones/tinciones.shtm consultado el dia 18 de merzo del 2012

http://www.slideshare.net/andresricote/tincin-simple-presentation consultado el dia 18 de marzo del 2012

http://mx.answers.yahoo.com/question/index?qid=20081004120212AAa1hrX consulatdo el dia 18 de marzo del 2012